Autor: Prof. Pablo Jesús Tamiozzo M.V. M.Sc. Dr, Prof. Bibiana Rosa Pelliza M.V. M.Sc., Prof. Alicia Isabel Carranza M.V. M.Sc.,Prof. Arnaldo Ambrogi M.V. M. Sc.
INTRODUCCIÓN
Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) es el agente etiológico primario de la neumonía enzoótica porcina (NEP), una enfermedad respiratoria crónica que causa pérdidas económicas significativas en la industria porcina a nivel mundial (Thacker, 2006). Para el control y la erradicación de la NEP, así como otras enfermedades, el método más eficaz es la despoblación total seguida de repoblación con animales libres del patógeno en cuestión (Harris, 2000), pero hay otras formas económica y operacionalmente menos costosas como la despoblación parcial. La despoblación parcial tiene una eficacia entre 80% y 90% para eliminar M. hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae (Bækbo, 2001) y es ampliamente utilizada en todo el mundo.
La literatura no es del todo clara cuando se refiere al éxito de estos programas en los que se hace alusión a: intento de erradicación (Smith & Mortimer, 2000), eliminación (Bækbo et al. 1994), intento de eliminación (Nielsen et al., 2002), eliminación (Alfonso et al., 2004) y exclusión de la infección (Kern et al., 1998). Esta variabilidad en las designaciones puede ser debida al éxito parcial en el desarrollo de los protocolos en cada caso en particular, o a los métodos de diagnóstico utilizados para el seguimiento de estos programas ya que pueden haberse utilizado técnicas con mayor o menor sensibilidad. Para intentar llegar a un consenso puede decirse que, erradicación de la enfermedad es la ausencia de eventos clínicos y patológicos pero la erradicación del patógeno es la ausencia total de éste, hecho que no siempre es posible.
En cuanto a las herramientas de diagnóstico para el seguimiento de los programas de control y/o erradicación de la enfermedad, los signos clínicos, la serología y la inspección de lesiones pulmonares en matadero son las más utilizadas. La presencia tos y las lesiones pulmonares son herramientas sugestivas. La serología, específicamente el ELISA, es el instrumento de diagnóstico más utilizado para determinar la presencia de M. hyopneumoniae en una piara, pero debido a la baja sensibilidad de las pruebas de ELISA disponibles (Erlandson et al., 2005), al retardo en la respuesta inmune (Thacker et al., 1998) o las diferentes interpretaciones de resultados serológicos (Sibila et al., 2004; Sørensen et al., 1997) esta prueba no debería utilizarse aisladamente, y otras técnicas de diagnóstico más sensibles podrían ser usadas conjuntamente. Por eso se hace necesario desarrollar técnicas más precisas o hacer uso combinado de las técnicas disponibles para identificar correctamente el estado de infección de las piaras, y por lo tanto ser capaces de responder al creciente interés en la erradicación de M. hyopneumoniae.
Según Thacker (2007) para implementar estrategias de erradicación de un organismo, es fundamental contar con técnicas de diagnóstico capaces de detectar con precisión animales infectados, por lo que la PCR debe ser considerada. Se ha sugerido que sus resultados deben ser cuidadosamente analizados en condiciones de campo (Thacker, 2006). Sin embargo, varios estudios informaron resultados significativos mediante PCR y serología para abordar la dinámica de la infección (Calsamiglia et al., 1999a; Sibila et al., 2004) en piaras de cerdos con sintomatología clínica, pero nunca había sido utilizada en el seguimiento de programas de erradicación.
Por lo tanto, teniendo en cuenta las diferentes capacidades de las pruebas de diagnóstico para detectar el agente, el objetivo de este estudio fue determinar la presencia de M. hyopneumoniae en granjas porcinas durante la ejecución de programas de erradicación utilizando diferentes técnicas diagnósticas, focalizando en la PCR.
MATERIALES Y MÉTODOS
El estudio se realizó en una empresa que poseía tres granjas. La granja A era un núcleo genético, parto-terminación, con 390 madres, proveedores de animales de reemplazo a la granja B. La granja B, una granja múltiple sitio, con aproximadamente 4100 madres. Ambas tenían medidas de bioseguridad internas y externas y tenían historia de NEP (tos no productiva y lesiones pulmonares en matadero, en el 76% de los animales). La granja C era un nuevo establecimiento, múltiple-sitio, con una proyección para 12000 madres que se estaba siendo poblada con cerdos de la granja B. Para asegurar una población libre de M. hyopneumoniae en la granja C, la compañía decidió aplicar un programa de despoblación parcial comenzando por la granja A, siguiendo con la granja B.
Entonces, todos los animales menores de 10 meses de edad fueron eliminados de las granjas, el plantel de reproductores remanentes (hembras adultas, machos y cachorras) fueron vacunados por lo menos con cinco dosis de vacuna contra M. hyopneumoniae (RespiSureONE, Pfizer, Argentina). Los servicios (y nacimientos) fueron interrumpidos por un período de 14 días en la granja A, y siete días en la granja B. Las instalaciones fueron limpiadas y desinfectadas. Todos los animales que fueron mantenidos en las instalaciones recibieron alimento medicado con 100 ppm de tiamulina (10% premezcla Dinamutilina®, Novartis, Argentina) y 300 ppm de clortetraciclina (CTC). Por un periodo de cuatro meses ningún animal de reemplazo fue introducido en las granjas. En las granjas A y B, se realizó un estudio longitudinal. Los lechones nacidos después de la reanudación de los nacimientos (primera semana) fueron considerados progenie libre de NEP. En la granja A, un total de 112 animales fueron seleccionados al azar y se tomaron muestras (con una semana de diferencia) en las semanas 1, 3 y 5, después de la reanudación de los partos, formando tres grupos: Grupo A (n = 37) Grupo B (n = 36) y Grupo C (n = 39). Éste n representó el 50% de la producción semanal. En la granja B, 163 cerdos fueron muestreados de la misma manera que en la granja A y también se formaron tres grupos: Grupo A (n = 52), Grupo B (n = 53) y Grupo C (n = 57). Éste n representaba el 15% de la producción semanal. En todos los casos se calculó una prevalencia estimada del 10% para la detección de al menos un positivo, con nivel de confianza del 95% y una precisión del 5%. Los animales que murieron durante el estudio no fueron reemplazados por otros.
Se tomaron muestras de sangre para serología (ELISA) e hisopados nasales para PCR anidada (nPCR) a la 2da, 10ma, 15a y 21a semanas de edad en la granja A y a la 2da, 8va, 15a y 21a semanas de edad en la granja B. En la granja B, a los 11 y 16 meses después de la aplicación del programa de despoblación parcial, fueron muestreados 100 cerdos de la fase de terminación a las 21 semanas de edad (100 animales en cada muestreo) tomando muestras de sangre para serología (ELISA).
En la granja A, al ser un núcleo genético, sólo los animales de descarte eran enviados a matadero, razón por la cual pulmones de cerdos contemporáneos de los grupos descritos anteriormente también fueron inspeccionados. Fueron enviados a faena 201 cerdos con una edad media de 21 semanas, y los pulmones se inspeccionaron en busca de neumonías cráneo-ventrales. En la granja B, cerdos pertenecientes a los grupos mencionados anteriormente fueron seguidos hasta el matadero, examinando un total de 132 pulmones en busca de neumonías cráneo-ventrales.
Para ocupar las nuevas instalaciones de la granja C, lechones de granja B fueron destetados a los 7-9 días de edad tratados con tulatromicina (Draxinn®, Pfizer, Argentina) y luego trasladados a las nuevas instalaciones de la granja C. En esta granja no se realizaron perfiles de nPCR ni perfiles serológicos y sólo los animales la fase de terminación fueron considerados (debido a los costos).
Fueron muestreados 10 grupos de 100 cerdos cada uno, a las 22 semanas de edad, tomando muestras de sangre para serología (ELISA). Las muestras de hisopos nasales para nPCR se recogieron sólo en los tres primeros grupos. Por la indisponibilidad de algunas muestras, finalmente fueron analizadas 987 muestras de suero y 216 muestras para nPCR. De éstos, 193 cerdos fueron seguidos hasta matadero, y los pulmones fueron examinados en busca de neumonía cráneo-ventrales. En todos los casos, de los animales que presentaban neumonías cráneo-ventrales, fueron tomadas muestras de pulmón, para su examen histopatológico (a veces más de una muestra por pulmón). Así fueron analizadas por histopatología 44 piezas pulmonares pertenecientes a animales de la granja A, 36 pertenecientes a animales de la granja B y 19 de la granja C. Además de todo esto en todos los grupos, los cerdos fueron observados en lo referente a la ocurrencia tos, diariamente, durante diez minutos por inspectores capacitados.
Tratamiento de las muestras
Serología: La presencia de anticuerpos contra M. hyopneumoniae se analizó por ELISA (HerdChek®, Mycoplasma hyopneumoniae, IDEXX, Maine, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los sueros con los valores de densidad óptica (OD) por encima del punto de corte fueron considerados positivos, y los restantes (sospechosos y negativos) como negativos.
nPCR: Los hisopos nasales fueron resuspendidos en 1 ml de agua bidestilada estéril y centrifugados a 10.000 x g durante 10 min a 4 ° C. A partir del sedimento se extrajo el ADN utilizando el kit comercial (DNAzol®, Invitrogen, CA, EE.UU.). Cada quince muestras, un hisopo vacío se incluyó como control negativo del proceso de extracción de ADN. La nPCR se hizo de acuerdo a los estudios anteriores (Calsamiglia et al., 1999b), excepto que no fue utilizado glicerol al 5%. Cada cinco muestras fue incluido como control negativo ADN de Mycoplasma floccculare, y cada 15 muestras, ADN de un cultivo puro de M. hyopneumoniae se colocó en la última posición como control positivo. Los productos amplificados (352 pb) se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con 0,5 ug / ml de bromuro de etidio y visualizados con luz UV. Para minimizar el riesgo de contaminación, cada paso del proceso (extracción del ADN, PCR y electroforesis) se llevó a cabo en habitaciones separadas.
Histopatología: Después de la fijación en formalina tamponada al 10%, las muestras de pulmón fueron deshidratadas, incluidas en parafina, seccionadas a 4 mm y teñidas con hematoxilina-eosina para el examen histológico. Las lesiones histopatológicas fueron clasificados (0 a 4) siguiendo el criterio de Calsamiglia et al. (2000). Sólo se consideraron las lesiones compatibles NEP con los que tenían una puntuación de tres o cuatro grados en la escala propuesta.
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico, se utilizó el programa Epidat (versión 3,1, Galicia, España). Fueron comparadas las proporciones de cerdos nPCR positivo de la siguiente forma: En las granjas A y B se comparó la proporción de animales nPCR positivos a las 2, 8- 10 y 15 semanas de edad, y las proporciones de los animales nPCR positivos obtenidos a las 21- 22 semanas se compararon entre las tres granjas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En las granjas A y B, en las cuales los cerdos fueron seguidos en el tiempo, el comportamiento serológico fue semejante a pesar de ser dos sistemas de producción diferentes (Tabla 1, Figura 1). En tanto, el porcentaje de cerdos seropositivos a las dos semanas de edad fue alto (85,9% en la granja A y 91,3% en la granja B), probablemente debido al estado inmunitario de las hembras (94,8% de las hembras seropositivas en la granja A y el 97,5% de las hembras seropositivas en la granja B después del parto (datos no mostrados) debido al esquema de vacunación utilizado.
En ambas se produjo un descenso en el nivel de anticuerpos maternos en el muestreo de las 15 semanas de edad , siendo positivos a ELISA 0/97 (0%) de los animales en la granja A y 1/144 (0,7%) en la granja B, de acuerdo con estudios anteriores (Jayappa et al., 2001; Carranza et al., 2004) para luego, en el muestreo de las 21-22 semanas aumentar ligeramente (dos reactores positivos en la granja A , y tres reactores positivo en la granja B). En la granja de C, el porcentaje de seropositivos fue de 3,3% (Tabla 1, Figura 1).
Cuadro 1. Positivos sobre el total de muestreados (y porcentajes) para ELISA y nPCR en los diferentes muestreos realizados en las granjas A, B y C. * Diferencia estadísticamente significativa (p=0,04); ‡ Diferencia estadísticamente significativa (p=0,02); † Diferencia estadísticamente significativa (p=0,05)
La baja proporción de cerdos seropositivos en la fase de terminación en las tres granjas y el hecho de que en la granja B (en los muestreos llevados a cabo a los 11 y 16 meses después de la aplicación del programa despoblación parcial) no hubo animales positivos, indican que la seroconversión fue mínima o nula. Una limitante de este estudio fue no tomar muestras de animales de más de 21-22 semanas de edad, para determinar finalmente si los animales habían seroconvertido, pero por razones de gestión y de comercialización no pudo realizarse dicho muestreo. Los resultados de nPCR mostraron que el agente permaneció en las instalaciones después del desarrollo del programa despoblación parcial en las granjas A y B y después de la población inicial en la granja C. La presencia de ADN de M. hyopneumoniae no indica una infección activa y es imposible distinguirla de una infección asintomática (colonización).
Figura 1 – Porcentaje de animales ELISA y nPCR positivos de los grupos seguidos en las granjas A y B en las diferentes edades de los cerdos después de la implementación del programa de despoblación parcial.
En este caso en que la tos no fue detectada, y la seroconversión y lesiones pulmonares fueron mínimos, podríamos decir que el agente se mantuvo, pero no en cantidad suficiente como para causar enfermedad.
En cuanto al tipo de piara, se detectó un comportamiento diferente entre ellos. En la granja A (parto-terminación) hubo picos de nPCR positivos (Figura 1). Esto puede ser debido a una eliminación intermitente de M. hyopneumoniae. El perfil obtenido en la granja B fue totalmente distinto, ya que el porcentaje de cerdos nPCR positivos disminuyó a medida que avanzaba la edad de los animales, de manera similar al patrón serológico (Figura 1). Esto refuerza la idea de que los sistemas de segregación de los animales, junto con el tratamiento antibiótico en forma pulsátil, son útiles para reducir la carga bacteriana en las instalaciones y retrasar la dispersión del microorganismo.
Aunque el muestreo utilizado no fue calculado para estimar prevalencia (sino al menos un positivo), la prevalencia esperada a las 2 semanas de edad seria igual o mayor a 8,9% en la granja A, e igual o superior a 18,4% en la granja B (habiendo diferencia estadísticamente significativa entre ambos).
En este estudio los resultados de nPCR observados en los lechones a las dos semanas de edad pertenecientes a las granjas A y B son importantes en dos sentidos. Por un lado, se ha sugerido que la prevalencia de la colonización nasal de los lechones puede ser un indicador de la diseminación de M. hyopneumoniae por parte de las hembras (Ruiz et al., 2003) y esto es consistente con nuestros resultados debido a que cerca del 20% de las hembras fueron nPCR positivas al post-parto (datos no mostrados) y éstas son, en este caso, la fuente más probable de infección, ya que el ambiente había sido saneado, a pesar de que el agente puede transmitirse a través del aire a más de tres kilómetros (Thacker, 2006). Por otra parte, también ha sido sugerido que la prevalencia de lechones PCR positivos al destete puede ser usado para predecir la gravedad de la enfermedad en cerdos en crecimiento y terminación (Fano et al., 2007) proponiendo que en los establecimientos múltiples sitios, con una prevalencia menor al 10%, la gravedad de la NEP sería menor.
En nuestro caso, podríamos decir que ambos rebaños tienen ciertamente más de 10% de prevalencia, pero debido a la terapia antibiótica, el sistema all-in/all-out y la segregación en varios sitios en la granja B, las lesiones pulmonares y la seroconversión fueron mínimas, o sea, fue reducida la gravedad de la NEP.
En cuanto a las lesiones microscópicas compatibles con NEP, las proporciones fueron las siguientes: 3/44 (6,8%) en la granja A, 3/36 (8,3%) en la granja B. En la granja C no hubo lesiones compatibles con NEP. En la granja A y la granja B, dos pulmones mostraron lesiones de grado tres y uno mostró típicas lesiones pulmonares microscópicas (grado cuatro): hiperplasia linfoplasmacítica perivascular y peribronquial, hiperplasia de neumocitos tipo II, edema del espacio alveolar, fluido con neutrófilos, macrófagos y células plasmáticas, nódulos linfoides perivasculares y peribronquiales –hiperproliferación del tejido linfoide asociado a los bronquios -BALT- (Calsamiglia et al., 2000).
Los porcentajes de lesiones microscópicas compatible con NEP fueron bajos en comparación con las que se encontrados antes del desarrollo de programa de despoblación parcial (datos no publicados). Cuando analizamos el porcentaje de cerdos nPCR positivos a las 21-22 semanas con el porcentaje de lesiones pulmonares, no existe una relación directa.
Esto puede ser explicado porque M. hyopneumoniae está presente en el pulmón, a pesar de no existir una infección (lesión inicial), o existe lesión, pero M. hyopneumoniae no es detectado por la nPCR o por el hecho de que las lesiones no son muy específicas y otros agentes pueden causar lesiones similares, como los virus de Influenza (Thacker et al., 2001) o Circovirus porcino tipo 2.
A las 15 semanas de edad, hubo diferencia estadísticamente significativa entre la proporción de nPCR positivo de la granja A y B. A las 21-22 semanas de edad en la granja A, hubo un 17% de nPCR positivos, porcentaje significativamente menor en las granjas B y C (Tabla 1). Todo esto puede sugerir un mayor éxito de este tipo de programas en granjas con segregación de animales.
En la granja C, hubo cerdos nPCR positivos en la etapa de terminación, que puede deberse, a pesar de que el destete se produjo entre 7 y 9 días de edad, a que estos animales ya eran portadores de M. hyopneumoniae al ocupar las nuevas instalaciones.
Esto significaría que el destete temprano medicado no es suficiente para prevenir la colonización de los lechones. Estudios previos de Harris (2000) han demostrado que, aplicando este método de destete, la erradicación es probable, pero no siempre es posible a pesar del tratamiento antibiótico de lechones y la inmunización de las madres.
El bajo porcentaje de cerdos seropositivos a las 21-22 semanas de edad en todos los casos y las lesiones macroscópicas y microscópicas compatibles con NEP no se consideran evidencia suficiente para concluir que la NEP no fue erradicada, ya que no hubo signos clínicos (tos), y las lesiones pueden ser causadas por otros agentes. Esta falta de evidencia es apoyada por los resultados de los monitoreos serológicos realizados en la granja B, a los 11 y 16 meses posteriores a la aplicación de la despoblación parcial ya que ambos muestreos fueron negativos. El uso de la PCR al destete permite la aplicación de algunas medidas para reducir el impacto de la enfermedad en los cerdos durante el crecimiento y terminación, ahorrando tiempo en relación con la inspección de lesiones pulmonares y la serología, ya que, para llevar a cabo estas técnicas de diagnóstico, se debe esperar que los cerdos lleguen al final de la fase de producción.
CONCLUSIÓN
En este estudio, M. hyopneumoniae se mantuvo en los establecimientos después de implementación de programas para el control/erradicación pero en pequeñas cantidades para causar la enfermedad. Hacemos hincapié en el uso de la PCR, una herramienta que debe ser aplicada como una técnica de diagnóstico de rutina en el seguimiento de los programas para el control del agente. Los resultados de la PCR pueden ser utilizado en conjunto con los obtenidos por otras herramientas de diagnóstico, tales como la observación de signos clínicos, la serología y la inspección de lesiones pulmonares en matadero para este tipo de monitoreo.
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