Pereyra M.E. ;Tamiozzo, P.J.; Ambrogi, A.
Universidad Nacional de Río Cuarto
Introducción
Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyopneumoniae) es el agente causal de la Neumonía Enzoótica Porcina (NEP). Por un lado se sabe que ni la vacunación ni la infección con cepas de baja virulencia protegen a los cerdos de infecciones posteriores con cepas de alta virulencia (Villarreal et al., 2009; 2011). Por otro lado para determinar la diversidad genética de M. hyopneumoniae el análisis de regiones repetidas en tándem (VNTR) ha demostrado ser una herramienta adecuada para la tipificación de este microorganismo de tan difícil cultivo (Vranckx et al., 2011), de las cuales cuatro han demostrado ser las más polimórficas (regiones R1 y R3 del gen p146, H4 y H5 -de Castro et al., 2006).
Particularmente la R3 del gen p146 puede ser identificada mediante la secuenciación y posterior deducción de una serie de repeticiones de serina previamente informadas (Mayor et al., 2007; Tamiozzo et al., 2011). Esta región fue usada en el presente trabajo para detectar diferencias genéticas entre cepas vacunales comercializadas en nuestro país.
Materiales y Métodos
Se utilizaron 4 bacterinas comerciales, designadas como vacunas A, B, C, y D. Las suspensiones fueron lavadas con 2 ml de solución salina bufferada y centrifugadas 30 min a 4°C a 9990 rpm, dos veces antes de la extracción del ADN. El mismo fue extraído con el kit comercial QIAamp stool mini kit (QIAgen). La primera ronda de amplificación de la PCR anidada se llevó a cabo con los cebadores y condiciones propuestas por Tamiozzo et al. (2011). La segunda ronda de amplificación se llevó a cabo utilizando como ADN templado 2 µl del producto de la primera reacción, con los cebadores y condiciones descriptos previamente por Mayor et al. (2007). Los productos obtenidos fueron purificados (kit QIAquick, QIAgen, Alemania), cuantificados y posteriormente secuenciados (ABI 3130xl, Applied Biosystems; INTA Castelar). El número de serinas repetidas en tándem se determinó visualizando las secuencias con el software Chromas 2.32 (Technelysium Pty Ltd.). Las secuencias de nucleótidos fueron alineadas empleando ClustalW.
Resultados
Dos bacterinas (A y D) evidenciaron 18 repeticiones de serina y las otras dos (B y C) mostraron 21 repeticiones.
Discusión
El conocimiento de las diferencias genéticas, proteómicas y antigénicas entre las cepas vacunales y las cepas de campo es muy importante ya que la vacunación es una de las herramientas de control de la NEP más utilizadas.
Se sabe que la cepa J (aislada en Inglaterra en 1961) es una cepa apatógena, sin capacidad de adhesión. Aparentemente la mayoría de las bacterinas comerciales actuales contienen esta cepa (Vranckx et al., 2012). Sin embargo, nuestros resultados muestran que solo 2 de las bacterinas mostraron el mismo número de repeticiones de serina que la informada con anterioridad para la cepa J (de Castro et al., 2006; Mayor et al., 2007).
Esto muestra que las otras dos cepas son distintas (al menos en esa región). Otra cepa que ha demostrado tener una serie de 21 repeticiones de serina es la cepa 232, que podría ser utilizada eventualmente en la fabricación de vacunas.
Por otro lado, las cepas vacunales con 18 o 21 serinas son distintas a cepas de campo analizadas en diferentes partes del mundo. Así, en Europa, Mayor et al. (2007) y Savic et al., (2010) detectaron un amplio rango de variabilidad, desde 12 hasta 44 unidades de repetición de serinas (analizando 142 muestras). En Argentina las diferencias entre cepas de M. hyopneumoniae provenientes de diferentes granjas también fue muy variable, observándose entre 13 y 21 series de repeticiones –sobre 39 muestras- (Tamiozzo et al., 2011). En nuestro país no se detectaron cepas de campo con 18 repeticiones de serina y lasmuestras con 21 repeticiones estuvieron limitadas a 2 establecimientos (sobre 7 estudiados).
Si bien los estudios de proteómica sugieren que las diferencias en la patogenicidad no estarían predominantemente a nivel genómico (Pinto et al.,2009) ya que después de la traducción las proteínas sufren modificaciones, el presente estudio muestra que al menos la mitad de las cepas vacunales analizadas no corresponderían (al menos en la región analizada) a la cepa J y muestran diferencias con cepas circulantes en elcampo.
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